[摘要] 目的 探讨肝癌组织中血管内皮生长因子-C（VEGF-C）、血管内皮生长因子-D（VEGF-D）和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）的表达及其在肝癌进展中的作用。 方法 收集2012年8月～2014年8月在广西壮族自治区南溪山医院（以下简称“我院”）住院行手术治疗的40例肝癌患者的癌组织及其无癌癌旁肝脏组织，同时选择我院同期收治的10例血管瘤患者的肝脏组织。采用免疫组织化学方法检测肝脏组织中VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3的表达，分析VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3表达在肝癌组织中的相关性。 结果 VEGF-C和VEGF-D主要表达于肝癌细胞浆内，它们在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常肝脏组织（P < 0.05）；VEGFR-3主要表达于肝脏组织基底层部位的癌细胞，VEGFR-3在肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织及正常肝脏组织（P < 0.01），并且VEGFR-3的表达与VEGF-C、VEGF-D的表达呈正相关（r = 0.546、0.369，均P < 0.01）。 结论 VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3在肝癌组织中表达明显增高，其可能与肝癌的发生发展有关，联合检测可作为判断肝癌发生和转移的重要指标。
[关键词] 肝癌；血管内皮生长因子-C；血管内皮生长因子-D，；血管内皮生长因子受伤-3
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（b）-0088-04
[Abstract] Objective To explore the expression of vascular endothelial growth factor C （VEGF-C）， vascular endothelial growth factor D （VEGF-D） and vascular endothelial growth factor receptor 3 （VEGFR-3） in liver cancer tissue and their role of the progression of liver cancer. Methods Liver tissues of 40 patients with hepatocellular carcinoma treated in Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region （"our hospital" for short） from August 2012 to August 2014 and their para-carcinoma tissues were collected， normal liver tissues of 10 patients with hemangioma in our hospital at the same period were collected. The expression of VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 of liver tissues were tested by immunohistochemical method， the relationship between VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 in liver tissues were analyzed. Results VEGF-C and VEGF-D was mainly expressed in the cytoplasm of liver cancer cells， and their expression in liver cancer tissues was significantly higher than para-carcinoma tissues and normal liver tissues （P < 0.05）. VEGFR-3 was mainly expressed in the cancer cells of base parts of the liver tissues and VEGFR-3 positive rate of the liver cancer tissues was obviously higher than those of the normal liver tissues and para-carcinoma tissues （P < 0.01）. The expression of VEGFR-3 was positively correlated with VEGF-C and VEGF-D （r = 0.546， 0.369； all P < 0.01）. Conclusion VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 are high expression in liver cancer tissues， and it may be associated with the development of the liver cancer. The joint detection can be used as an important index of judging liver cancer occurrence and metastasis.
[Key words] Liver cancer； VEGF-C； VEGF-D； VEGFR-3
肝细胞肝癌（hepatocelluarcarcinoma，HCC）作为一种常见的恶性肿瘤，起病隐匿，缺乏早期诊断标准[1]，进展迅速，早期诊断困难，确诊时大多数已达晚期。症状以黄疸、腹痛和腹部肿块为主，治疗方法以手术切除为主，预后较差，其病因和发病机制目前未完全明确。有研究发现，肝癌的生长代谢、浸润转移和复发与肿瘤淋巴管及血管生成密切相关[2-4]。
血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）通过促淋巴管及血管生长的作用，从而对肝癌的发生、发展产生影响。研究发现多种肿瘤的淋巴转移与血管内皮细胞生长因子C（VEGF-C）的表达有相关性，在淋巴管内皮细胞中有血管内皮细胞生长因子受体3（VEGFR-3）高表达[5]，在人体血管内皮细胞生长因子D（VEGF-D）可以视作一个血管生成因子，它可以促进肿瘤血管的形成与生长[6]。目前鲜见有文献报道VEGFR-3、VEGF-C及VEGFR-D与肝细胞肝癌的研究，本研究通过对肝癌组织及正常肝脏组织的VEGFR-3、VEGF-C及VEGFR-D的表达进行检测，进一步了解VEGFR-3、VEGF-C及VEGFR-D在肝癌中的病理作用。
1 对象与方法
1.1 对象
选择2012年8月～2014年8月广西壮族自治区南溪山医院（以下简称“我院”）病理科确诊为肝细胞性肝癌的40例患者的癌组织以及其癌旁正常组织，癌旁组织均为肝脏肿瘤旁的组织，均经病理检测为无癌正常细胞。同时选择我院同期非肝癌患者的正常肝组织标本10例。肝癌患者平均年龄（52.5±11.5）岁，男30例，女10例，TMN分期：Ⅰ期有14例，Ⅱ期有15例，Ⅲa期11例；非肝癌患者平均年龄（54.0±11.6）岁，男8例，女2例。肝癌患者两组年龄、性别与非肝癌患者比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 实验试剂
兔抗人VEGF-C、VEGFR-3多克隆抗体、鼠抗人VEGF-D单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；PV-9000二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 实验方法
材料首先经过4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后按照4 μm规格连续切片，之后常规HE染色、免疫组化。SP兔二步法进行免疫组化；VEGF-C抗体进行稀释，其倍数是1∶200；VEGF-D抗体进行稀释，其倍数是1∶400；VEGFR-3抗体进行稀释，其倍数是1∶300；LYVE-1抗体进行稀释，其倍数是1∶100。
1.4 结果判读方法
由我院病理科经验丰富，且不知道受检者任何临床和病理资料的2名专业医师独立对VEGF-C、VEGFR-D和VEGFR-3的免疫组化切片进行判读、评估。首先在低倍镜下（100倍）分别选取瘤周（肿瘤浸润边缘区）和瘤内脉管最丰富的区域，即“热点”；然后在高倍显微镜下（200倍）随机计数5个视野，以其均值作为该病例的LVD计数。原发性肝细胞性肝癌组织选择阳性脉管最丰富区，在200倍视野下计数淋巴管数目，每例计数5个视野，并求其均值。VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3的判断：采用染色指数计数法，参照1996年全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会意见：细胞质或核内见淡黄色细颗粒明显高于背景色为阳性细胞。
1.5 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，等级资料相关分析用Spearman等级相关，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3在不同肝脏组织中的表达
VEGF-C和VEGF-D主要表达于肝癌细胞胞浆内，它们在肝癌组织中的表达明显高于肝癌癌旁组织及正常肝脏组织（P < 0.05）；VEGFR-3主要表达于肝脏组织基底层部位的癌细胞，VEGFR-3在肝癌组织中的阳性表达率明显高于肝癌癌旁及正常肝脏组织（P < 0.01）；VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3在肝癌癌旁组织与正常肝脏组织中的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
2.2 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达的相关性分析
VEGFR-3的表达与VEGF-C（r = 0.546）、VEGF-D（r =0.369）的表达呈显著正相关（P < 0.01），而VEGF-D与VEGF-C无明显相关性（P > 0.05）。
3 讨论
肝癌是临床常见的一种恶性肿瘤，其转移的分子机制还不明确，研究原发性肝细胞性肝癌的机制和转移规律具有重要临床价值。原发性肝癌具有易转移、预后差、易复发等特点，肿瘤组织所具有侵袭转移的特点正是肝癌预后差、易复发的病理学基础。研究发现，肝癌细胞的转移途径有4种[7]：第一种为血行转移，是最常见、最早的转移途径，肿瘤可经血行转移至门静脉可形成瘤栓，可导致一些并发症如多发性转移病灶、门静脉高压以及顽固性腹水。通过血行癌细胞还可侵袭肝外组织，如肺、脑等。血行转移是肝细胞肝癌最常见的转移方式。第二种是癌细胞通过淋巴道系统转移，最常见转移至肝门淋巴结，另外锁骨上淋巴结和主动脉旁淋巴结等处的转移也比较多见。临床上胆管细胞型肝癌的淋巴道转移发生率仅次于血行转移。第三种为种植转移途径，临床上不多见。第四种转移途径为直接浸润，临床上偶见浸润周边器官如膈、胃、网膜。血行转移和淋巴转移是临床最常见的转移方式，特别是通过淋巴转移的癌细胞更难以清除。目前研究发现肿瘤的生长、浸润、转移和复发都是依靠肿瘤新生血管和淋巴管的形成[8-10]，如果控制肿瘤的新生血管的出现和淋巴管生成就能够有效地控制肿瘤的生长及进展。
血管及淋巴管生成的主要调控因子——VEGF家族及其受体（VEGFR），通过与其受体结合发挥促淋巴管及血管生长的作用，在肿瘤中促进新生毛细血管生成，介导血管内皮细胞生成、增殖和迁移，并且诱导淋巴管生成、增加血管通透性，是肿瘤淋巴管和血管生成的重要因子[11]，与肿瘤的侵袭和转移密切相关。研究发现，VEGF-C属于血小板源性生长因子，是酪氨酸激酶受体如VEGFR-3和VEGFR-2的配体，对VEGFR-3有较高的亲和力[12]。高表达的VEGF-C可以促进皮肤淋巴管的增生[13]，它参与了新生血管的形成以及病理性和生理性淋巴管的形成[14-15]。近年来研究发现VEGF-C 的表达与多种肿瘤的淋巴转移有关，并与肿瘤的浸润深度关系密切[16-17]，下调VEGF-C能减缓肿瘤在体内的生长[18]。VEGFR-3表达主要位于是在淋巴管的内皮细胞[5]，它是淋巴管的内皮细胞的特异性分子标志物[19]。VEGFR-3[20]的一些内皮细胞发生分化和增生，再向周围进行伸展，以发芽的方式成为淋巴管。VEGF-D在人体内可以视作一个血管生成因子，能够促进肿瘤新生血管的形成与发展。Nakamura等[21]进行研究表明VEGF-D的能够与VEGFR-3结合进而促进淋巴管出现、肿瘤经淋巴道的转移。
通过对肝癌患者及正常人群的肝脏组织中VEGF-C、VEGFR-D、VEGFR-3的表达进行研究发现，在肝癌组织中这些因子表达明显高于正常肝脏组织，它们的高表达有可能促进了新生血管的形成和新生淋巴管的出现，进而加快了肿瘤的生长及转移，从而影响HCC患者的预后。同时，相关研究也发现，VEGF-C参与了肝恶性肿瘤转移及淋巴转移过程[22]。研究发现在肝细胞型肝癌可发现VEGFR-3显著上调[23]。同时，本研究发现VEGFR-3在癌旁组织和正常组织中的表达低于癌组织中的表达，表明肝癌的发生发展可能与VEGFR-3上调有关，VEGFR-3的上调可能促进淋巴管的形成；因为新生的淋巴管有着不完整的基底膜，有利于癌细胞的迁移，肿瘤细胞从而进入基底膜空隙通过淋巴管发生转移[4， 24-26]，对肝癌的转移有促进作用，影响肝癌的预后。
虽然本实验发现VEGF-C、VEGF-D和受体VEGFR-3在肝癌组织中表达，但是具体的分子机制仍需进一步研究并证实，同时本研究进一步了解了VEGF与HCC可能存在的关系，为了解肝癌的转移及治疗提供了一个新的方向。
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（收稿日期：2016-04-03 本文编辑：任 念）