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摘要：DNA甲基化是一种重要的 DNA 修饰方式，它能在不改变 DNA一级结构的情况下调控基因的表达，能够维持正常的细胞功能，在胚胎发育、遗传印记中起重要作用。以黄鳝为对象，采用限制性内切酶-PCR检测特定DNA 片段是否发生甲基化的方法，研究不同温度、pH值、光照周期条件下DMRT基因在各组织中的甲基化差异。用甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ酶切黄鳝的性腺、肾、脾、肝、肠等5个组织，根据已知的DMRT2、DMRT3、DMRT4 基因序列设计特异的引物扩增酶切产物，并设置未酶切对照组，用1%琼脂糖检测，分析差异条带，若未酶切组泳道出现条带，酶切组泳道也出现条带则判定为阳性结果，否则判定为阴性结果。结果表明：不同生态因子条件下，在5个组织中DMRT2-FR2扩增序列中的位点均表现为阳性结果；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3扩增序列中的位点均表现为阴性结果，说明这4个序列中位点的甲基化状态非常稳定，环境因子的小幅变化对其影响不大。
关键词：黄鳝；温度；光照；甲基化
中图分类号： S966.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0060-04
收稿日期：2015-04-30
基金项目：江苏省科技支撑计划 （编号：BE2013315）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 （编号：2015JBFM06）；江苏省自然科学基金 （编号：BK2011184）。
作者简介：吴秀林（1990—），女，重庆人，硕士研究生，主要从事水产动物遗传育种研究。E-mail：764859546@qq.com。
通信作者：邴旭文，研究员，主要从事特种水产养殖与育种研究。E-mail：bingxw@ffrc. cn。黄鳝（Monopterus albus）是重要的淡水经济鱼类，隶属硬骨鱼纲辐鳍亚纲合鳃目合鳃科黄鳝属，其肉质细嫩、营养丰富，具有较高的食用价值、药用价值。黄鳝多生活在河道、湖泊、沟塘等水体中，我国的珠江流域、长江流域盛产黄鳝。泰国、印度尼西亚等国也有黄鳝分布[1]。研究发现，黄鳝繁殖比较特殊，具性逆转现象，一般经历雌性发育阶段—间性发育阶段—雄性发育阶段，这种独特的生理现象使得黄鳝成为研究探讨鱼类性别控制机理的极好材料[2]。DMRT基因家族成员的典型特征是具有一个保守的DM结构域，DM 是一个靠特殊的锌指结构连接DNA 的结构域，通过调节目的基因转录参与发育调节过程[3]。目前，已在多种鱼类体内检测到 DMRT 家族基因[4]。DMRT基因普遍被认为与性别分化有关，如DMRT1、DMRT2、DMRT3与雄性性别分化密切相关，对精巢正常发育有重要作用。Kim等研究发现，小鼠DMRT3参与性腺、脑与脊髓等的发育，且在雄性中比雌性的表达量高[3]。Kondo等在青鳉（O. latipes）成体精巢中检测到有DMRT3的表达，并且在其成体精巢、卵巢等器官中发现有DMRT2和DMRT4的表达，推测DMRT2、DMRT3和DMRT4可能参与青鳉精子的发生[5]。王佳等通过对鲫 DMRT3 基因的克隆和表达分析，发现 DMRT3可能在早期器官发生和雄性性腺发育调控中起作用[6]。环境因子对鱼类的生长、摄食、代谢、生殖以及内分泌等产生间接而广泛的影响[7]。阮国良等以雌性幼鳝为对象，研究不同光照周期对其生长和性腺发育的影响，结果表明，黄鳝在黑暗状态下其生长和性腺发育均得到改善[8]。Navarro-Martín等研究发现，温度可刺激欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）性别转化并可影响性别比例，但影响机制尚不明确[9]。表观遗传学是指在不改变DNA序列的情况下，基因的表达产生可遗传变异。DNA甲基化是一种与基因抑制相关的表观遗传机制，是表观遗传学的重要组成部分[10]。DNA甲基化由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNA Mtase）催化，S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供体，在胞嘧啶的第5 位碳原子上加上一甲基基团形成甲基化脱氧胞嘧啶的共价修饰过程[11]，是最常见的复制及转录后修饰方式之一，在基因表达调控、发育调节等方面发挥重要作用[12]。Jabbari等通过比较42种脊椎动物体内5-甲基胞嘧啶的甲基化程度，得出鱼类和两栖动物机体甲基化是鸟类和哺乳动物的2倍，且CPG比例前者较高[13]。Varriale等研究对比了南极与热带鱼类机体甲基化程度，结果表明，南极鱼类甲基化程度明显高于热带鱼类，由此推断动物机体甲基化程度与其体温相关[14]。本研究探讨了不同温度、pH值、光照周期条件下，DMRT基因在黄鳝各组织中的甲基化差异，旨在为黄鳝性别调控研究提供一种分子学角度的方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物试验所用黄鳝来自南京农业大学无锡渔业学院南泉试验基地，对养殖环境进行单因素控制，分别控制养殖水体温度、pH值、光照时间3个生态因子。每个生态因子设置3个梯度试验组，每个梯度试验组设置2个平行，每个平行养殖4条黄鳝；设置1个空白对照组，空白对照组设置2个平行，每个平行养殖4条黄鳝。水体温度分别为25、28、31 ℃；pH值分别为6.5、7.5、8.5；光照时间分别为8、10、12 h。总样本数为80条黄鳝，雌雄各半。
1.1.2试验仪器22331 Hamburg PCR仪（Eppendorf公司），低温离心机（Sopvall公司），紫外分光光度计（Eppendorf公司），无菌操作台，琼脂糖凝胶成像系统，高压湿热灭菌锅，水浴锅，电热恒温干燥箱，电子天平，电泳仪及电泳槽，各种型号加样枪，微波炉，烘箱，恒温振荡器，-70 ℃超低温冰箱，4 ℃ 冰箱。
1.1.3试验试剂 去离子水、70%乙醇、STE缓冲液、Tris-Cl饱和酚、蛋白酶K、三氯甲烷、异丙醇、TaKaRa LA TaqTM、HpaⅡ、Marker DL2000、10×Loading Buffer、EB、50×TAE Buffer、琼脂糖。
1.2方法
1.2.1总DNA的提取取黄鳝各组织迅速将其磨碎，加入500 μL STE缓冲液和10 μL蛋白酶K于55 ℃下3～4 h，用Tris-Cl饱和酚、三氯甲烷各抽提1次，取上清液并加入等体积的异丙醇，混匀后放于4 ℃冰箱过夜，12 000 r/min离心 10 min，弃上清，用300 μL 70%乙醇洗沉淀2次，加入100 μL ddH2O溶解，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性，将样品储存在-70 ℃下保存备用。
1.2.2引物设计笔者所在实验室前期工作中，根据已知的DMRT2、DMRT3、DMRT4 基因启动子区富含 CpG的序列，分别设计5对引物：DMRT-F1、DMRT-R1，DMRT-F2、DMRT-R2，DMRT-F3、DMRT-R3，DMRT-F4、DMRT-R4 以及 DMRT-F5、 DMRT-R5，经过筛选比较，发现用DMRT2-FR2、DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物能扩增出较好的条带。所以本试验采用DMRT2-FR2、DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物（表1）。
1.2.3黄鳝基因组DNA的酶切将提取的DNA产物中加入10 U/μL HpaⅡ酶0.5 μL，于37 ℃水浴中酶切4 h（表2）。
1.2.4黄鳝DMRT基因酶切产物的扩增及检测酶切产物PCR体系：10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Taq酶 0.25 μL，正反引物各0.5 μL，DNA模板 1 μL，用ddH2O补足25 μL。扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，59 ℃（60 ℃）45 s，72 ℃ 1 min，34个循环；最后4 ℃保存。上述PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，置于紫外分光光度计下观察，拍照记录结果并对结果进行甲基化位点分析。
2结果与分析
2.1不同温度下DMRT基因的酶切结果
水温分别控制为25、28、31 ℃，取黄鳝性腺、肾脏、肝脏、脾脏、肠等5个组织的基因组DNA用DMRT2-FR2引物扩增后，酶切组和未酶切组均有条带，表明DMRT2-FR2扩增序列中的位点均是甲基化的；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物扩增后，未酶切组有条带，酶切组没有出现条带，说明这3个扩增片段中的位点均是阴性结果。图1表示，水温为28 ℃下黄鳝肝基因组用DMRT4-FR2引物扩增后的酶切结果。表3表示不同温度下黄鳝各组织的甲基化统计结果。
2.2不同pH值下黄鳝各组织DMRT基因的酶切结果
水体pH值分别控制为6.5、7.5、8.5环境下，黄鳝性腺、肾脏、肝脏、脾脏、肠等5个组织的基因组DNA用DMRT3-FR2引物扩增后，酶切组和未酶切组均有条带，表明DMRT3-FR2扩增序列中的位点均出现阳性结果；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物扩增后，未酶切组有条带，而酶切组没有出现条带，说明这3个扩增片段中的位点均出现阴性结果。图2表示pH值为6.5条件下黄鳝性腺基因组用DMRT3-FR2引物扩增后的酶切结果。表4表示不同pH值下黄鳝各组织的甲基化统计结果。
2.3不同光照周期下DMRT基因的酶切结果
养殖网箱每天光照时间控制在8、10、12 h环境下，黄鳝性腺、肾脏、肝脏、脾脏、肠等5个组织的基因组DNA用DMRT3-FR2引物扩增后，酶切组和未酶切组均有条带，表明DMRT3-FR2扩增序列中的位点均表现为阳性结果；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物扩增后，未酶切组有条带，酶切组没有出现条带，说明这3个扩增片段中的位点均变现为阴性结果。图3表示光照时间为10 h下黄鳝肾脏基因组用DMRT4-FR3引物扩增后的酶切结果，表5表示不同光照时间下黄鳝各组织的甲基化统计结果。
对比表3、表4、表5可以得出，不同生态因子条件下黄鳝各组织的DMRT基因酶切后的扩增结果是一致的，DMRT3-FR2扩增序列中的位点均是甲基化的；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3的扩增序列中的位点均是去甲基化的。
3结论与讨论
本试验将PCR引物设计在酶切位点的两侧，DNA被酶切后，只有发生甲基化不被切割的DNA才能被PCR扩增，检测有条带，反之则无条带。结果表明，黄鳝性腺、肾、脾、肝、肠等5个组织在不同的光照周期、pH值、温度下的甲基化状态是一致的，DMRT3-FR2扩增序列中的位点均是甲基化的；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3扩增序列中的位点均是去甲基化的。本研究采用限制性内切酶结合PCR的方
法进行甲基化位点研究，具有简单、快捷的特点。覃扬等建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法，研究P16基因启动子区甲基化状态。结果表明，所采用的HpaⅡ酶切后半巢式PCR方法的特异性强，灵敏度达100 fg，说明该试验方法简便、成本低廉，并且有高度的特异性与灵敏度，实际应用价值高[15]。
体细胞中大多数常染色体基因的CpG岛保持非甲基化状态，只有一小部分在正常组织和细胞中发生甲基化，表明甲基化位点在生物体内存在广泛，同时对基因的表达存在着一定的调节功能。Navarro-Martin等研究发现，1龄欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）的脑组织中，cyp19a启动子甲基化程度不受性别和温度的调控；在性腺中，cyp19a启动子甲基化程度雄鱼是雌鱼的2倍，但在高温下雌鱼cyp19a 启动子甲基化程度有所增加；在脑和性腺中，管家基因β-actin启动子的甲基化程度也与性别和温度无明显关系[9]。本试验结果与其相似。欧洲鲈鱼的性别受基因型和温度的双重控制，由于这种特殊的性控机制，若在其性腺形成前改变温度，则可以影响其性别比例。cyp19a基因编码cyp19a芳香化酶，该酶的活性影响性激素比值。更重要的是在大多数变温脊椎动物中，环境温度控制性别比例均是通过调控cyp19a基因的表达量而实现的。Varriale等研究对比了南极与热带鱼类机体甲基化程度，结果表明，南极鱼类甲基化程度明显高于热带鱼类，推测动物机体甲基化程度与体温呈负相关，但是，他们发现属于虎鱼科鲭科和丽鲷科的鱼类机体甲基化程度与其体温呈正相关，即使是相同体温的鱼类，其机体甲基化程度也有明显差异，所以他们认为其他因子如水深、产地、驯化时间及新陈代谢率等都会对鱼类机体甲基化程度产生影响[14]。Jabbari 等研究也证明，除了体温外，存在甲基化的序列数量和基因片段长度也会影响动物机体甲基化程度[13]。Varriale等研究结果表明，热带鱼类水温控制范围为20～30 ℃，极地鱼类水温控制范围为0～10 ℃，温差较本试验设置的温度梯度（25、28、31 ℃）差异大很多，可能导致结果[14]不一致。
甲基化作为DNA修饰的重要途径，是表观遗传学的重要组成部分，也成为目前的研究热点[16]。本试验所用方法可以快速检测多个基因的启动子甲基化状态，是其他方法无法达到的。但在试验过程中需要特别注意HpaⅡ酶切时要确保酶切完全，否则残余的微量未被HpaⅡ切开的未甲基化5′-CCGG-3′ 就可能作为 PCR反应的模版导致假阳性的出现。为了验证本试验建立的HpaⅡ限制性内切酶方法是否具有广泛的适用性，将进一步在更多的其他鱼类中进行确证应用，为该方法的推广应用提供丰富的科学依据。
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